液相色譜儀根據固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)。現代液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣系統、溫度控制系統、色譜柱、檢測器、信號記錄系統等部分組成。與經典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點。對高沸點、難氣化合物的混合物通過色譜柱和淋洗劑并以實現分離。應用于生物化學、生物醫學、環境化學、石油化工等部門。

工作原理

系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。

儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統。

? 進樣系統

一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。

? 輸液系統

該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47～4.4X10Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存器和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。

? 分離系統

該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10-50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管)，內徑為2-5mm，由優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內裝有直徑為5-10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成)，固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達1000)和比表面積大的特點，加之其表面經過機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學法偶聯各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

另外，固定相基質粒小，柱床易達到均勻、致密狀態，易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

? 檢測系統

高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。

（1）紫外檢測器

該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣(如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測下限為10-10g/ml)；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

（2）示差折光檢測器

凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低(檢測下限為10-7g/ml)，流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。

（3）熒光檢測器

凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物(如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等)的測定，其靈敏度很高(檢測下限為10-12～10-14g/ml)，痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。

? 數據處理系統

該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

應用

高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩定和非揮發性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質。

與試樣預處理技術相配合，HPLC所達到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能，能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發展，有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問題理想的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用，流出組分易收集等優點，因而被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析等各種領域。

高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發展方向。液相色譜-質譜連用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜連用也發展很快如在環境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發烴類，使環境污染分析得到新的發展。

流動相流速選擇

因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。

對于一根特定的色譜柱，要追求理想柱效，那就使用理想流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當選用理想流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

濾膜選擇

1、常見濾膜

水系過濾膜，一般用于純水相的過濾。在過濾含有機相的混合溶劑時應盡量避免使用水系濾膜，以防濾膜被溶解，因為水系濾膜一般由醋酸纖維素類的材料制成，耐有機溶劑性能較差。

有機系濾膜，本身也能過濾水，但水比較難浸潤有機系濾膜，有些有機濾膜在水中超聲幾分鐘使其浸潤，或用有機溶劑潤濕后也可以用于水系溶劑過濾。可以當然也可以先過濾甲醇再過濾水。混合系濾膜也可以用于水系溶劑過濾。但是，水系濾膜相對經濟。

油系溶劑，采用專用的油系過濾膜，用于有機溶劑的過濾。混合系濾膜也可以用于有機溶劑過濾。

另外，如果該用有機相的濾膜，用了水的濾膜，濾膜會被溶解掉，導致管路堵塞。如果該用水的濾膜，用了有機相的濾膜，則流動相很難流下去。

2、微孔過濾膜

再生纖維素膜(Regenerated Cellulose Membranes，RC)為疏水型濾膜，具有非特異性吸附低，特別適合于除微粒過濾，其化學兼容性強，可以耐受大多數有機溶劑，其化學兼容性如下表所示。直徑50mm和47mm，孔徑0.45µm作為標準用于溶劑的超凈和脫氣過濾以及HPLC 流動相的過濾。主要用于有機溶劑的過濾。

醋酸纖維素膜(Cellulose Acetate Membranes，CA)具有理想流速和熱穩定性以及低吸附。0.2µm的濾膜適合于水溶液、緩沖液、血清和培養基的除菌過濾。0.45µm的濾膜適合于HPLC的流動相過濾。關于得到膜吸附的公開結果是比較困難的，其與過濾的物質、過濾的條件和采用的測定方法以及被測定的膜沒有被預先除菌有關。主要用于水相溶液的過濾。

硝酸纖維素(Cellulose Nitrate Membranes，CN)是理想的濾膜材料，其能提供非常一致的孔徑結構和寬的孔徑規格。大的孔徑(8µm，5µm和3µm)用于趨藥性和細胞截留，0.45µm用于微粒收集，小孔徑(0.1µm)用于溶液的超凈過濾和光散射測量。這種類型濾膜所具有的非特異性吸附性能使其利于許多印跡處理過程和診斷試劑的應用。用于樣品預處理，顆粒檢測或除顆粒。

聚四氟乙烯膜(PTFE Membranes，PTFE)采用PTFE材質，即使在很低的壓差下，也能保證潮濕空氣或其它氣體通行無阻，而水溶液則不能透過。其性能與親水膜正好相反。PTFE濾膜具有強化學兼容性，能勝任所有的有機溶劑和強腐蝕化學品的過濾。在必須用PTFE濾膜過濾水相溶液時，須先用乙醇或異丙醇預浸潤后，水相溶液才能濾過。用于空氣、氣體和疏水性化學品的過濾。

玻璃纖維濾膜(Glass Fiber Filters，GF)屬于深層過濾，其主要用途是作為于過濾層，直接加在過濾膜上使用。注意，不同尺寸的濾器對預過濾膜的直徑都有具體的要求，直徑過大時，其邊緣會伸到密封圈下引起漏液。用于提高過濾通過率和連續過濾。

尼龍膜(Polyamide Membranes，Nylon)具有理想機械強度，吸附性強，能耐受大多數有機溶劑和多數堿性溶液，適合于堿性溶液的過濾。用于有機溶劑過濾，如HPLC流動相除顆粒過濾時，尼龍膜比PTFE膜更經濟實用，另外，尼龍膜還可作為轉印膜。由于尼龍膜的吸附性能相對較高，一般不推薦用于培養基過濾或蛋白液等生物樣品的過濾，以免因吸附而損失樣品。在這種情況下，通常采用低吸附的醋酸纖維素膜(CA)，更為適用。用于堿性溶液和有機溶劑過濾。

使用注意要點

1、流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質(使用0.45um或更細的膜過濾)；

2、流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用；

3、不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液；

4、使用緩沖溶液時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上；

5、長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相(如甲醇等)，因為純水易長霉；

6、每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器；

7、C18柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品；

8、堵塞導致壓力太大，按預柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗。清洗方法：①以異丙醇作溶劑沖洗；②放在異丙醇中間用超聲波清洗；③用10％稀硝酸清洗；

9、氣泡會致使壓力不穩，重現性差，所以在使用過程中要盡量避免產生氣泡；

10、如果進液管內不進液體時，要使用注射器吸液，通常在輸液前要進行流動相的清洗；

11、要注意柱子的PH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品；

12、更換流動相時應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然后插入新的流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。

常見故障的斷定及解決

1、保留時間變化

? 柱溫變化，柱恒溫，必要時需配置恒溫箱；

? 等度與梯度間未能充分平衡，至少用10倍柱體積的流動相平衡柱；

? 緩沖液容量不夠用，25mmol/L的緩沖液；

? 柱污染，每天沖洗柱；

? 柱內條件變化，穩定進樣條件，調節流動相；

? 柱快達到壽命，采用保護柱。

2、保留時間縮短

? 流速增加，檢查泵，重新設定流速；

? 樣品超載，降低樣品量；

? 鍵合相流失，流動相PH值保持在3-7.5檢查柱的方向；

? 流動相組成變化，防止流動相蒸發或沉淀；

? 溫度增加，柱恒溫。

3、保留時間延長

? 流速下降，管路泄漏，更換泵密封圈，排除泵內氣泡

? 硅膠柱上活性點變化，用流動相改性劑，如加三乙胺，或采用堿至鈍化柱

? 鍵合相流失，流動相PH值保持在3-7.5檢查柱的方向；

? 流動相組成變化，防止流動相蒸發或沉淀；

? 溫度降低，柱恒溫。

4、出現肩峰或分*

? 樣品體積過大，用流動相配樣，總的樣品體積小于*峰的15%；

? 樣品溶劑過強，采用較弱的樣品溶劑；

? 柱塌陷或形成短路通道，更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；

? 柱內燒結不銹鋼失效，更換燒結不銹鋼，加在線過濾器，過濾樣品；

? 進樣器損壞，更換進樣器轉子。

5、鬼峰

? 進樣閥殘余峰，每次用后用強溶劑清洗閥，改進閥和樣品的清洗；

? 樣品中未知物，處理樣品；

? 柱未平衡，重新平衡柱，用流動相作樣品溶劑(尤其是離子對色譜)；

? (TFA)氧化(肽譜)每天新配，用抗氧化劑；

? 水污染(反相)通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水。

6、基線噪聲

? 氣泡(尖銳峰)，流動相脫氣，加柱后背壓；

? 污染(隨機噪聲)，清洗柱，凈化樣品，用HPLC級試劑；

? 檢測器燈連續噪聲，更換氘燈；

? 電干擾(偶然噪聲)，采用穩壓電源，檢查干擾的來源(如水浴等)；

? 檢測器中有氣泡，流動相脫氣，加柱后背壓。

7、峰拖尾

? 柱超載，降低樣品量，增加柱直徑采用高容量的固定相；

? 峰干擾，清潔樣品，調整流動相；

? 硅羥基作用，加三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值，鈍化樣品；

? 柱內燒結不銹鋼失效，更換燒結不銹鋼，加在線過濾器，過濾樣品；

? 柱塌陷或形成短路通道，更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；

? 死體積或柱外體積過大，連接點降至理想低，對所有連接點作合適調整，盡可能采用細內徑的連接管；

? 柱效下降，用較低腐蝕條件，更換柱，采用保護柱。

8、峰展寬

? 進樣體積過大，用流動相配樣，總的樣品體積小于*峰的15%；

? 在進樣閥中造成峰擴展，進樣前后排出氣泡以降低擴散；

? 數據系統采樣速率太慢，設定速率應是每峰大于10點；

? 檢測器時間常數過大，設定時間常數為感興趣*峰半寬的10%；

? 流動相粘度過高，增加柱溫，采用低粘度流動相；

? 檢測池體積過大，用小體積池，卸下熱交換器；

? 保留時間過長，等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫；

? 柱外體積過大，將連接管徑和連接管長度降小；

? 樣品過載，進小濃度小體積樣品。